Localización de secuencias específicas
Cuando se introduce el vector en la célula huésped es necesario asegurar la identificación de la molécula recombinante dentro de esta. Sin embargo, para identificar las células transformadas, es preciso aclarar que no todas las células huésped integran al vector, sólo un pequeño porcentaje logran expresar el ADN recombinante y su identificación se logra añadiendo marcador genético al ADN con gen reportero o centinelas cuyos genotipos se identifican fácilmente.
Existen diferentes genes marcadores que detectan la inserción de ADN en las células huéspedes por ejemplo: genes resistentes a antibióticos, vectores artificiales, gen para la enzima luciferasa y gen para la proteína de fluorescencia verde entre otras.
Las formas de identificar las células transformadas dependen del tipo de marcador elegido. Primero se hace crecer el marcador en un medio sólido con una concentración de células huésped muy baja; de tal manera que cuando se divide y crece fácilmente, se puede identificar la nueva colonia por la resistencia a un determinado antibiótico o por la expresión de una proteína fluorescente verde.
Estas colonias se inoculan o introducen en medios líquidos enriquecidos para hacerlas reproducir y obtener grandes cantidades de un organismo transgénico. Usualmente se utiliza la bacteria Escheriquia coli (célula procarionte) por su facilidad de cultivo en el laboratorio, o la levadura Saccharomyces (célula eucarionte) pues el tamaño de su genoma (20 millones de pares de bases) es relativamente pequeño. También las células vegetales aisladas pueden integrar el ADN recombinante y, una vez cultivadas en un medio de crecimiento específico, pueden ser inducidas a formar una planta transgénica.
Escheriquia coli en cultivo
Bacterias: Se emplea la bacteria E. coli como célula huésped, es además un plásmido que contiene genes que le confieren resistencia a los antibióticos tetraciclina y ampicilina. La activación a la tetraciclina se logra cuando se inserta ADN extraño en el sitio de restricción (con secuencia GGATCC). La enzima de restricción Bam HI no puede leer el gen para la resistencia a la tetraciclina. Las bacterias que contienen al plásmido con la secuencia de ADN extraño, llevan el gen que le confiere, a la bacteria, resistencia a la ampicilina, sin embargo, no expresa el gen que le da resistencia a la tetraciclina; de modo que las bacterias que contienen el ADN recombinante crecerán en un medio con ampicilina, ya que son sensibles a la tetraciclina pero resistentes a la ampicilina.
