Localización de secuencias específicas
Cuando se introduce el vector en la célula huésped es necesario asegurar la identificación de la molécula recombinante dentro de esta. Sin embargo, para identificar las células transformadas, es preciso aclarar que no todas las células huésped integran al vector, sólo un pequeño porcentaje logran expresar el ADN recombinante y su identificación se logra añadiendo marcador genético al ADN con gen reportero o centinelas cuyos genotipos se identifican fácilmente.
Existen diferentes genes marcadores que detectan la inserción de ADN en las células huéspedes por ejemplo: genes resistentes a antibióticos, vectores artificiales, gen para la enzima luciferasa y gen para la proteína de fluorescencia verde entre otras.
Las formas de identificar las células transformadas dependen del tipo de marcador elegido. Primero se hace crecer el marcador en un medio sólido con una concentración de células huésped muy baja; de tal manera que cuando se divide y crece fácilmente, se puede identificar la nueva colonia por la resistencia a un determinado antibiótico o por la expresión de una proteína fluorescente verde.
Estas colonias se inoculan o introducen en medios líquidos enriquecidos para hacerlas reproducir y obtener grandes cantidades de un organismo transgénico. Usualmente se utiliza la bacteria Escheriquia coli (célula procarionte) por su facilidad de cultivo en el laboratorio, o la levadura Saccharomyces (célula eucarionte) pues el tamaño de su genoma (20 millones de pares de bases) es relativamente pequeño. También las células vegetales aisladas pueden integrar el ADN recombinante y, una vez cultivadas en un medio de crecimiento específico, pueden ser inducidas a formar una planta transgénica.
Escheriquia coli en cultivo
Bacterias: Se emplea la bacteria E. coli como célula huésped, es además un plásmido que contiene genes que le confieren resistencia a los antibióticos tetraciclina y ampicilina. La activación a la tetraciclina se logra cuando se inserta ADN extraño en el sitio de restricción (con secuencia GGATCC). La enzima de restricción Bam HI no puede leer el gen para la resistencia a la tetraciclina. Las bacterias que contienen al plásmido con la secuencia de ADN extraño, llevan el gen que le confiere, a la bacteria, resistencia a la ampicilina, sin embargo, no expresa el gen que le da resistencia a la tetraciclina; de modo que las bacterias que contienen el ADN recombinante crecerán en un medio con ampicilina, ya que son sensibles a la tetraciclina pero resistentes a la ampicilina.
Levadura vista al microscopio
Levaduras: Los plásmidos bacterianos no se replican en las levaduras porque las secuencias de ADN procarionte y eucarionte tienen diferentes orígenes de replicación. Para solucionar este problema, los científicos han creado un cromosoma artificial de levadura (YAC) que contiene el mismo origen de replicación de la levadura natural, además de la secuencia para el telómero y centrómero de la misma, comportándose por tanto, como un cromosoma eucarionte. Contiene también sitios de restricción únicos, sintetizados artificialmente, así como marcadores genéticos específicos para levadura.
Tumor en planta provocado por Agrobacterium tumefaciens
Células vegetales: El plásmido Ti (inductor de tumores) de la bacteria Agrobacterium tumefaciens se emplea como vector en muchos tipos de plantas. Parte del plásmido Ti es T ADN, un transposón que se autoreplica en los cromosomas de las células vegetales infectadas. En la región T ADN del plásmido se puede cortar y empalmar ADN externo con ayuda de enzimas de restricción. Si se reemplaza el T ADN, el plásmido ya no produce tumores, pero el transposón con el ADN nuevo se inserta en la célula huésped llevando el gen de interés, para luego ser cultivada o inducida con la finalidad de formar una nueva planta.